Binning de metagenomas

Análisis de MAGs

Objetivos

El objetivo de este taller es comprender las estrategias de binning y generar bins (o verdaderos MAGs), para luego usar algún sistema especializado de anotación de genomas, clasificarlos y visualizarlos. Para esto se usaran nuevamente las muestras de metagenomas de pacientes con VIH y sin VIH, que fueron ensambladas a nivel de contigs mediante megahit. Los contigs se encuentran disponibles en el directorio ~/Datasets/Taller8. Los archivos son:

Archivo Descripción
control.contigs.renamed.fa Contigs de un muestreo al 10% del control (Q_C3)
case.contigs.renamed.fa Contigs de un muestreo al 10% del caso (Q_H1)

Note que estos fueron generados usando megahit:

megahit -1 SRR13452514_1.f10.fastq.gz -2 SRR13452514_2.f10.fastq.gz -o <outdir>
megahit -1 SRR13452521_1.f10.fastq.gz -2 SRR13452521_2.f10.fastq.gz -o <outdir>
Advertencia

Si desean pueden usar los archivos de los contigs generados en la práctica anterior por ustedes mismos, bajo su responsabilidad y riesgo 😬

Consulte la presentación de esta clase en este link.

I. Binning de MAGs

  1. Realice el binning de los metagenomas de las dos muestras usando Vamb. Para esto, primero debe concatenar el catálogo de contigs de las muestras de control y caso. Luego, mapee las lecturas de cada muestra al catálogo de contigs con minimap2 y genere los archivos BAM correspondientes. Finalmente, realice propiamente el binning con vamb:

Use el ambiente de conda vamb-4.1.3 para correr vamb. Si está enviando un trabajo a un cluster, recuerde que debe activar el ambiente de conda antes de correr el comando, para eso utilice source activate vamb-4.1.3. Las funciones concatenate.py y el paquete minimap2 están disponibles en el mismo ambiente.

  • Concatenar el catálogo de genes de las muestras de control y caso.
concatenate.py catalogue.fna.gz <contigs-case>.fa <contigs-control>.fa
minimap2 -d catalogue.mmi catalogue.fna.gz;
  • Mapear las lecturas de cada muestra al catálogo de contigs con minimap2 y genere los archivos BAM correspondientes.
minimap2 -t 8\
         -N 5\
         -ax sr catalogue.mmi\
         --split-prefix mmsplit\
         <reads-fraction-forward>.fastq.gz <reads-fraction-forward>.fastq.gz\
         | samtools view -F 3584 -b --threads 8 > <{case|control}>.bam
Bono

¿Qué hace la linea de comando samtools view -F 3584 -b --threads 8 > <{case|control}>.bam

  • Correr binning con Vamb
vamb --outdir <outdir> --fasta catalogue.fna.gz --bamfiles <maped-reads-{case|control}>.bam -o C

  1. Revisa los bins generados mediante al menos una de las herramientas vistas anteriormente (BUSCO, QUAST, CheckM, etc.). Muestre y describa las estadísticas de calidad de los bins generados y concluya sobre la calidad de los mismos.

  2. Discuta sobre el número de bins generados a la luz de cada una de las muestras. ¿Qué puede concluir sobre el número y de los bins generados en cada muestra?

II. Clasificación, Anotación y Visualización de los bins

  1. Para clasificar los bins generados, use la herramienta GTDB-Tk y el comando classify_wf. Revise la clasificación taxonómica de los bins y describa el lineaje taxonómico de los bins de cada muestra.

Para la clasificación de los bins generados, use el ambiente de conda gtdbtk-2.3.2. Si está enviando un trabajo a un cluster, recuerde que debe activar el ambiente de conda antes de correr el comando, para eso utilice source activate gtdbtk-2.3.2.

gtdbtk classify_wf --genome_dir <bins-dir> --out_dir <classified-bins> --skip_ani_screen

  1. Anote el bin más completo de cada muestra de forma general mediante bakta del mismo modo que anotó los contigs en la práctica anterior. Muestre el resumen de la anotación del bin más completo en cada una de las muestras.

  2. Ingrese a Proksee y visualice el bin más completo de cada muestra. Describa las características y muestre la visualización que obtiene luego de utilizar los parámetros de la interfaz.1

III. Análisis especializado de los bins

  1. Planteé una pregunta de investigación sencilla que pueda ser resuelta mediante el análisis de una anotación especializada (e.g. AMRs, BGCs, CGCs) de los bins generados que permita entender las diferencias muestras de control y caso. Provea una justificación (preámbulo) de la pregunta. Apóyese en el artículo de origen de los metagenomas 2.

  2. Muestre el resumen de la anotación especializada de cada uno de los bins más completos en cada una de las muestras y discuta los resultados a la luz de pregunta de investigación planteada.

  1. Notarás que la anotación de los genomas o bins puede hacerse directamente en Proksee, esto es posible pero recuerde dar la información de las estadísticas de anotación.↩︎

  2. Bai, X, et al., 2021↩︎